RNAscope常見問題小貼士 | 掉片、沒信號以及特殊樣本問題
美國Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技術作為新一代的RNA原位雜交技術，通過其專利的雙Z探針設計原理以及信號級聯放大系統，可以兼容由于空氣中RNA酶對于RNA的部分降解導致一定程度的組織RNA缺損，從而達到對組織和細胞內的RNA進行高效的原位檢測。
在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope對石蠟樣本，新鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進行原位雜交的過程中，經常會遇到各種各樣的技術問題。前三期我們就樣本制備，樣本預處理的一些注意細節，以及問題樣本預處理調整方案進行了探討，本期繼續就其他一些客戶常見問題給大家提供一些相關小貼士。
在解決了樣本制備和預處理問題后，客戶還會遇到的一些RNAscope檢測常見問題有：
1 掉片問題
掉片多見于石蠟樣本和固定冰凍樣本。說是多見，并不意味著這是一個普遍現象，通常按照ACD產品說明書里的樣本制備方法進行的樣本制備和其他標準流程操作，掉片現象并不常見。當發現實驗中出現掉片現象時，可以通過以下幾點進行調整：
01
確保使用高粘附載玻片
與免疫組化不同，ACD的包括RNAscope, Basescope，miRNAscope等的操作流程相對較長，除前期預處理的三個主要步驟，探針雜交2小時以外，后續還要根據檢測試劑盒的不同，有若干步Amp的孵育，直到最后顯色（可見光或者熒光）。所以公司推薦使用高粘附的進口載玻片進行組織切片的粘附和后續檢測。具體可選用的載玻片請參見說明書或直接與我公司的技術人員交流(chinaACDFAS@bio-techne.com)。
02
按照公司推薦的標準流程制備組織樣本
具體的樣本制備方法在前幾期的軟文以及公司產品說明書里都有描述，這里不再贅述。
03
在進行貼片時盡量避免氣泡，適當延長烤片時間
貼片時，當組織切片與載玻片間沒有完全牢固貼合上，則會降低由于電荷間吸附力下降導致的空隙，在后續檢測時，這些不牢固區域會導致掉片；石蠟切片建議在60℃烤箱烤1小時。在脫片的情況下，可以適當延長到1個半小時。而固定冰凍樣本切片也可以通過增加烤片環節增加粘附（時間可以控制在60℃半小時）。
04
對于石蠟切片和固定后冰凍切片，如果遵守上述操作后仍然有掉片問題，可以參考增加以下步驟進行操作。
石蠟切片可以在第一步烤片后或者target retrieval之后增加烤片環節，降低脫片問題（見上圖）。
固定后冰凍切片可以在上圖的I（-20℃低溫干燥2小時），II（進行后固定），III（增加烤片60℃ 30分鐘環節）和IV（去除煮沸步驟但是同時增加蛋白酶處理）環節進行相應調整。最終達到以下右圖效果。
2 靶探針沒有結果
在遇到這類問題時，第一時間需要確認樣本的陽性對照探針（通常包括PPIB或者UBC）和陰性對照探針(DapB)結果如何。在眾多此類問題中，有一多半的客戶在確認了陽對和陰對探針結果后，都可以很好的回答靶探針沒信號的問題。即由于樣本本身制備過程中未按照標準流程，固定不充分，導致RNA大幅度降解，故無法檢測到靶探針信號。
針對樣本質量沒有問題的客戶，則可以與我們的技術人員聯系（chinaACDFAS@bio-techne.com），尋求進一步的幫助和指導。
3 特殊樣本怎么辦
在常規的樣本外，經常會遇到客戶使用的是包括類器官，骨骼樣本以及血液等較為特殊的樣本類型，對于這些種類的樣本，有專門的樣本處理和制備方法，可以幫助完成前期包括固定，脫鈣，包埋等一系列問題，最終放置到載玻片上進行常規RNAscope, Basescope等檢測。相關制備細節可參見本公眾號之前發表的軟文，或與我們的技術部門同事聯系詢問細節。
最后，在開始實驗前注意以下環節，將有助于避免實驗中的常見錯誤，保證整個實驗的順利進行。
下一期，我們將RNAscope熒光檢測的一些常見問題進行探討，與大家一起了解并加深熒光檢測的操作細節和關鍵點。
RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發的RNA原位雜交產品，在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優勢如下：
應用廣泛
使用RNAscope技術，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細胞定量
使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標RNA發生部分降解，仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結果穩定一致性
RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成，且該技術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
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